Количественный метод впч вкр
Диагностирование ВПЧ осложняется вялым развитием процессов в молодом организме, которые часто не дают специфической симптоматики. Для выявления болезни на ранней стадии и профилактического контроля заболеваемости используют централизованный скрининг на ВПЧ ВКР.
Что такое скрининг ВПЧ ВКР
Скрининг – это целенаправленное обследование определенных групп населения с целью выявить заболевание. Скрининг проводится по специально разработанной методике подготовленным персоналом.
ВПЧ представляет собой заразные штаммы ДНК содержащего папилломавируса.
Все папилломавирусы (а их насчитывается больше сотни) делят на:
- высокоонкогенные штаммы – вирусы, которые способны вызвать дисплазию тканей кожи или слизистых человека, с последующим их злокачественным перерождением;
- низкоонкогенные – группа вирусов, деятельность которых вызывает доброкачественные образования (папилломы, бородавки).
Обратите внимание! Аббревиатура ВКР означает высокий канцерогенный риск. ВПЧ ВКР – так обозначают штаммы вируса, которые вызывают рак. У женщин это рак шейки матки, у мужчин – рак полового члена. Для Европейских жителей и населения России это 18, 16, 31 и 45 генотипы папилломавируса.
При активизации ВПЧ типа ВКР происходит изменение и перерождение тканей, которое оканчивается злокачественным процессом.
Скрининг на папилломавирусы высокой степени онкогенности проводят пошагово, по специально разработанной схеме:
- Проведение анализа цервикального мазка на предмет наличия или отсутствия измененных клеток (дисплазии) в организме пациента (ПАП тест).
- При положительной реакции на ПАП-тест проводят количественное определение вируса, его идентификацию (расширенный скрининг).
Фото 1: Скрининг на ВПЧ ВКР показан всем женщинам, начиная с 24 летнего возраста. Проводится должен при прохождении плановой диспансеризации населения, при профессиональных медосмотрах, по личному обращению пациентки. Источник: flickr (Eugene Evehealth).
Рекомендуемая периодичность мероприятия 1 раз в 3 года.
Обратите внимание! Скрининг позволяет снизить заболеваемость раком половых органов в сотни раз, что имеет важное значение при растущей тенденции заражения.
Показания для сдачи анализов
Показанием для сдачи анализов является:
- появление кондилом (иных новообразований) на половых органах, в анальной зоне или ротовой полости;
- выделения из половых органов неясной этиологии;
- личное беспокойство человека по поводу возможного заражения после незащищенного контакта;
- профилактический контроль.
Важность обследования
Важно! Выявление дисплазии тканей слизистых половых органов на ранней стадии имеет решающее значение при прогнозе эффективности терапии. Раннее выявление ВПЧ ВКР в организме позволяет принять превентивные терапевтические меры для его уничтожения.
От инфицирования до развития рака проходит от 5 до 15 лет. Выявление латентной формы присутствия вируса в организме дает:
- возможность динамического контроля состояния половых органов и деятельности вируса (вирусоносителям повторяют обследование ежегодно);
- возможность раннего лечения, когда прогноз наиболее благоприятен.
Статистика показывает, что рак шейки матки занимает 3 место среди онкологии половых органов женщины. Исследования причин развития онкопатологии матки подтверждают прямую связь между инфицированием ВПЧ ВКР и последующим развитием рака.
Фото 2: Каждая 8 из 10 женщин, перешагнувших 50-летний рубеж, заражена или переболела ВПЧ. Эта цифра увеличивается год от года в связи с все большей сексуальной активностью населения. Источник: flickr (Eugene Evehealth).
Виды скрининга на ВПЧ ВКР
Наиболее информативной и недорогой является методика скрининга, которая используется в России – исследование на цитологию позволяет на первом этапе «отсеять» здоровых обследуемых, дальнейшее исследование проводить только пациентам с выявленной дисплазией тканей.
Анализ на цитологию (ПАП-тест)
ПАП-тест это анализ по методике Папаниколау.
Этот вид тестирования отличает высокая точность анализа.
Для проведения анализа делается забор материала из цервикального канала шейки матки у женщин или уретры у мужчин. Процедура безболезненная, проводится в условиях обычного осмотра.
Материал помещается либо на стекло (уходящая практика), либо в специальную жидкостную среду, что удобнее для проведения исследования.
Жидкостный ПАП-тест берется специальной щеточкой, которая помещается в подготовленную жидкую среду для транспортировки и хранения. Такая методика забора и хранения биоматериала позволяет сохранить и проанализировать все клетки взятого эпителия.
Как подготовиться к процедуре
Для того, чтобы ПАП-тест был максимально достоверным следует соблюдать несколько условий:
- за 2 дня до посещения врача отказаться от половых контактов, спринцеваний, введения вагинальных медицинских средств;
- женщинам визит следует планировать в первой половине менструального цикла, но после полного окончания месячного кровотечения;
- исследование не проводят в период обострения хронических инфекций или остропротекающих заболеваний;
- исследование не проводят непосредственно после курса антибактериальной или противовоспалительной медикаментозной терапии.
Расширенный скрининг
Обратите внимание! Расширенный скрининг представляет собой контролируемый забор биоматериала для проведения анализа в режиме реального времени на определение не только наличия или отсутствия ВПЧ, но и типа, количества папиллома вируса человека онкогенной группы.
Анализ проводится методом ПЦР качественного направления на основе RT-PCR.
Данная методика позволяет интерпретировать результаты анализов для расшифровки по Дайджин-тесту. И корректировать дальнейшую тактику работы с пациентом.
Забор биоматериала не отличается от обычного взятия мазка. Требования по подготовке к расширенному тестированию такие же как и к ПАП-тесту:
- Воздержание от применения лекарственных средств влагалищных за 2 суток до;
- Воздержание на этот же период от половых контактов;
- Отсутствие менструального кровотечения.
ПЦР анализ
Анализ выявления ВПЧ с использованием полимерно-цепной реакции (ПЦР-тест) на его ДНК обладает высокой степенью достоверности. С его помощью можно определить:
- факт инфицирования;
- генотип папилломавируса;
- степень распространения (количественный анализ).
Анализ возможен на любой жидкости из организма пациента: кровь, слизистое отделяемое, моча.
Подготовка
- Женщинам не следует сдавать биоматериал из влагалища во время менструации;
- Мужчинам запрещено мочиться за 1,5 часа до процедуры;
- Кровь сдают на голодный желудок;
- При заборе материала из половых органов женщинам запрещено спринцеваться накануне вечером;
- Исключаются любые медикаменты за 2 дня до проведения забора биоматериала.
Результаты анализов
- Тест по Папаниколау (ПАП-тест) может быть отрицательным (измененные клетки не обнаружены) или положительным (во взятом образце обнаружены онкоклетки);
- ПЦР-тест показывает наличие или отсутствие ВПЧ;
- Расширенный скрининг определяет тип вируса и его количество.
Количественный результат по Дайджин-тесту интерпретируется:
- менее 3 Lg – концентрация вируса незначительная;
- от 3 Lg до 5 Lg – средняя степень присутствия;
- более 5 Lg – высокая концентрация ВПЧ.
Источник
Автор статьи
Практикующий-дерматовенеролог, окончил Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова.
Вирус папилломы человека (ВПЧ) – распространенное заболевание, протекание которого носит хронический характер и чревато рецидивами. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – один из самых современных способов диагностики папилломавируса. Этот способ считается надежным и позволяет выявить не только наличие вируса в организме, но также его тип и количество. ПЦР чувствителен даже к неактивной форме вируса, при которой отсутствуют внешние проявления в виде папиллом и кондилом.
Общие сведения
Анализ строится на исследовании ДНК пациента с целью обнаружения в ней присутствия чужеродных элементов. Любая ДНК строится на основе четырех нуклеотидов, располагающихся в определенной последовательности. Когда в организм попадает вирус, происходит изменение порядка в этой цепи, что позволяет оперативно отследить деятельность даже незначительных инородных частиц. Метод ПЦР диагностики проводится с использованием вирусных частиц, что обусловливает быстрое деление клеток.
Такая диагностика способна отследить активность ВПЧ не только в момент его протекания в скрытой фазе, но и в инкубационный период, когда папилломавирус еще не успел заявить о себе. ПЦР позволяет выявить:
- наличие ВПЧ;
- штаммы, которыми инфицирован больной;
- количественное содержание вируса в организме.
Большинство людей инфицированы папилломавирусом, однако сильный иммунитет подавляет его проявления и не дает размножаться. Поэтому обнаружение ВПЧ качественным методом может быть не всегда оправдано. Это не рационально в случае, если вирус присутствует в организме, но его воздействие минимально и никак не вредит человеку. Тем не менее качественный анализ покажет положительный результат, чем может вести пациента в замешательство.
Поэтому для диагностики чаще всего применяют количественный метод, позволяющий отследить количество вируса в организме и определить, насколько опасна его деятельность. Кроме того, важно установить штамм ВПЧ. Они делятся по степени онкогенности: одни совершенно безопасны и способны вызывать только косметические проблемы, другие могут стать причиной возникновения рака.
Каждая ситуация требует индивидуального подхода, поэтому прежде чем сдавать анализ, желательно проконсультироваться с врачом. Он подскажет, каким методом и на какие штаммы лучше всего проверяться, исходя из состояния пациента.
Показания для анализа
Инфицирование ВПЧ возможно только при непосредственном контакте с зараженным человеком. Вирус попадает в кровь и начинает размножение в области верхних слоев кожи, что обусловливает появление его характерных признаков – возникновение папиллом и кондилом. 
ВПЧ распространяется следующими путями:
- при незащищенных половых контактах;
- при естественных родах от инфицированной матери к ребенку;
- контактно-бытовым путем через предметы общего пользования, личные вещи, одежду и т.д.;
- во время тесного контакта с кожей больного.
Чаще всего диагностировать ВПЧ приходят люди, у которых видны внешние признаки болезни. Однако если они никак не проявляются, это не является гарантией отсутствия вируса. Он также может присутствовать в крови и развиваться бессимптомно. Это особенно характерно для высокоонкогенных типов вируса: 16 и 18 штамма, которые провоцируют возникновение рака. Направление на диагностику этих типов обычно происходит при обращении к профильным специалистам: гинекологу и урологу. 
Преимущества метода
ПЦР считается одним из главных методов диагностики и остается самым востребованным среди врачей. Он используется не только для выявления ВПЧ, но также помогает обнаруживать другие заболевания, передающиеся половым путем, гепатиты, скрытые инфекции и т.д. ПЦР диагностика обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами выявления заболеваний. Среди них:
- Высокая специфичность. Тест помогает с большой вероятностью отделить следы чужеродной ДНК от ДНК человека в рамках собранного материала.
- Высокая производительность. ПЦР представляет собой автоматизированный процесс, помогающий провести диагностику непосредственно в день сдачи анализа. Такая скорость исследования позволяет пациенту не волноваться о результате на протяжении долгого времени и получить результат уже через несколько дней.
- Возможность сделать сразу несколько анализов. На основании одного собранного образца можно провести диагностику для выявления нескольких заболеваний. Например, одновременно можно выявить возбудителя хламидиоза и гонореи. При этом такая процедура не сможет отрицательно повлиять на достоверность результата.
- Высокая чувствительность. Тест позволяет обнаружить деятельность вируса даже в инкубационный период, когда его концентрация очень мало. Это поможет предупредить развитие патологического процесса и начать своевременное лечение.
Недостатки метода
Существуют, однако, и некоторые отрицательные моменты в проведении ПЦР диагностики. Главный из них – возможность получения ложноположительного результата. Это происходит в случае, если лечение уже проведено, инфекция побеждена, но мертвые клетки еще остаются внутри тканей. Для обновления клеток необходимо время.
Если провести анализ раньше 2-3 месяцев, ПЦР может показать положительный результат, в действительности принимая уже мертвые клетки за живые. Метод не делает различий между ними, он нацелен на поиск ДНК вируса, которую может найти даже в уже отмерших клетках. Все это приводит к получению ложноположительного результата. Избежать такой ситуации можно, если сдавать анализ в установленный лечащим врачом срок.
Также существует риск ложноотрицательного результата. В этом случае пациент никак не может повлиять на качество диагностики, так как ложноотрицательный анализ – просчет лаборатории. Он может возникнуть если:
- собранный материал неправильно транспортировался и хранился;
- нарушается стерильность, и в полученные пробы попадают другие микроорганизмы;
- реагенты были непригодными.
Для того чтобы исключить возможность получения ложноотрицательного результата, необходимо выбирать проверенную лабораторию с квалифицированным персоналом.
Виды методик
В рамках проведения ПЦР диагностики разработаны четыре метода тестирования. Каждый из них имеет свои особенности проведения и назначается, исходя из состояния пациента. Для выбора наилучшего способа необходимо проконсультироваться с врачом.
Качественный способ
Этот метод применяется для того, чтобы подтвердить или опровергнуть факт присутствия вируса в организме. Его основной недостаток – невозможность установить штамм ВПЧ (только 14-21 виды). Чаще всего качественный способ используется вместе с другими методами выявления папилломавируса. Результат при этом передается с помощью 2 оценок: «обнаружено» или «не обнаружено». То есть метод либо констатирует факт наличия чужой ДНК, либо показывает ее отсутствие.
Генотипирование
Методика способна определить как просто наличие вируса в организме, так и установить его вид. Этот способ применяют, когда необходимо установить, осталась ли вирусная ДНК после лечения или случился рецидив вследствие нового заражения. Генотипирование позволяет оценить эффективность проведенного лечения посредством определения вида вируса. Если этот тот же штамм, от которого лечился больной, значит, терапия прошла безуспешно. Если же исследование показывает другой вид ВПЧ, можно говорить о повторном заражении. Результат также представлен формулировками «обнаружено» или «не обнаружено».
Комбинированный метод
Узкоспециализированный способ диагностики, основанный на соединении качественного метода и определения 16 штамма посредством генотипирования. Результат представлен 3 ответами: «не обнаружено», «обнаружен 16 штамм», «обнаружен ВПЧ с 16 типом включительно». Этот метод применяется при подозрении на наличие высокоонкогенного типа папилломавируса, способного вызывать у женщин рак шейки матки.
Количественный метод
Такой способ позволяет установить концентрацию вируса в организме и отследить развитие ВПЧ. Считается наиболее информативным, так как позволяет определить тяжесть протекающего процесса, исходя из которой, подбирается лечение. Основан на определении количества вирусных клеток в рамках исследуемых 100 тысяч. Когда их совокупность превышает 5, это свидетельствует о высокой концентрации папилломавируса, что повышает возможность появления раковых клеток. Если количество клеток меньше 3, концентрация указывается как незначительная.
Как сдавать анализ
Специальной подготовки для проведения диагностики не требуется. Главное условие – не мочиться за несколько часов до процедуры. Желательно не вступать в половые контакты за 2-3 дня до обследования, а также не принимать алкоголь. При этом нельзя забывать о проведении процедур для поддержания интимной гигиены.
Как сдают анализ мужчины
Головка полового органа вместе с мочеиспускательным каналом обрабатывается физ. раствором. Врач использует специальную щеточку, вставляемую примерно на 4 сантиметра. С помощью легкого вращения собирается материал для исследования с уретры. Полученный анализ оставляется в пробирке и отправляется на дальнейшее исследование в лабораторию. Биоматериал при этом может храниться не более 2 суток с момента получения.
Как сдают анализ женщины
Перед взятием анализа на шейку матки наносят стерильный раствор. Затем с помощью щеточки берется мазок из цервикального канала. Приспособление оказывается на глубине около сантиметра, потом врач делает соскоб со стенок вращательными движениями. Биоматериал помещается в пробирку, где находится примерно 15 секунд. Там врач обтирает его об стенки, а затем вынимает. После этого содержимое пробирки отправляется на диагностику.
Забор биоматериала
Правильный забор материала – залог успешного проведения диагностики. Если при этом процессе нарушается стерильность, и в пробирку попадают чужеродные микроорганизмы, может произойти обнаружение «вируса», которого в действительности нет. Кроме того, ошибка может произойти из-за небольшого количества клеток, взятых на анализ.
Расшифровка анализа ПЦР
В зависимости от способа диагностики пациент увидит различные контрольные результаты. Графа «не обнаружено» свидетельствует о том, что вирус не присутствует в организме, либо его количество настолько незначительно, что не поддается обнаружению. Результат «обнаружено», соответственно, говорит о наличии патологического процесса.
Если пациент использовал количественный метод, расшифровка будет следующей:
- Lg 5 и выше – показатель большой концентрации вируса;
- Lg 3−5 – уровень вируса значительный, но не критический;
- Lg меньше 3 – малозначимое количество вирусных клеток.
В любом случае точной расшифровкой должен заниматься врач, ведь на основании этого ставится диагноз. Кроме того, через какое-то время желательно повторить процедуру, чтобы исключить ложноотрицательный или ложноположительный результат.
Источник
Лабораторная диагностика папилломавирусной инфекции – важнейший элемент скрининга и профилактики рака шейки матки (РШМ), что объясняется подтверждением этиологической роли вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии данного заболевания.
Преимуществами тестирования на ДНК ВПЧ являются простота взятия материала, автоматизация метода, унифицированность получаемых результатов, быстрота выполнения исследования, высокая специфичность у женщин старше 30 лет (у подростков и молодых женщин из-за высокого показателя спонтанной элиминации вируса клиническая интерпретация положительного результата должна проводиться с осторожностью).
Метод классической ПЦР, позволяющий определить только факт наличия/отсутствия в биоматериале пациента ВПЧ, недостаточно информативен. Определение типа вируса позволяет оценить риск развития неоплазии и дифференцировать персистенцию вируса от случая нового заражения при динамическом наблюдении. Высокая вирусная нагрузка рассматривается как один из факторов, снижающих спонтанную элиминацию вируса и увеличивающих риск развития неоплазии. Поэтому в последнее время широкое распространение получили количественные тесты по определению клинически значимых типов ВПЧ.
Метод ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (RT-PCR), позволяющий определить количество ДНК клинически значимых типов ВПЧ в образце. Технологические особенности RT-PCR позволяют врачу-клиницисту подобрать оптимальный вариант диагностического лабораторного обследования каждого пациента и, при необходимости, динамического мониторинга ВПЧ. Стандартизация диагностических тест-систем на основе RT-PCR дает возможность пересчёта полученных результатов в единицы Digene (метод, считающийся «золотым» стандартом для определения ВПЧ), поэтому все клинические рекомендации по интерпретации результатов Digene-теста могут быть применены для результатов, полученных методом RT-PCR.
Необходимым условием корректного количественного анализа является чёткое соблюдение техники получения соскоба эпителиальных клеток, поэтому в состав пакетов по диагностике и мониторингу ВПЧ введен специальный параметр – контроль взятия материала (КВМ). КВМ представляет собой количество геномной ДНК человека в биоматериале, источником которой являются эпителиальные клетки, попадающие в пробу при правильной технике взятия биоматериала. КВМ позволяет количественно оценить адекватность взятия соскоба, а также произвести пересчёт результатов исследования на клетки человека.
Выявляемые показатели: индивидуальные результаты количественного определения клинически значимых типов ВПЧ (21 тип HPV + КВМ):
- высокого онкогенного риска (16; 18; 26; 31; 33; 35; 39; 45; 51; 52; 53; 56; 58; 59; 66; 68; 73; 82);
- низкого онкогенного риска (6, 11, 44).
Материал для исследований:
- для женщин: соскоб эпителия с границы здоровой ткани цервикального канала и шейки матки;
- для мужчин: соскоб эпителия уретры.
Взятие образцов урогенитальных соскобов. Для получения объективного результата необходимо, чтобы исследуемый материал содержал возможно большее количество эпителиальных клеток и минимальное количество слизи и примеси крови. Неадекватное взятие биоматериала контролируется специальным параметром – КВМ. Взятие урогенитальных соскобов проводится стерильным одноразовым зондом в пластиковые пробирки объемом 2 мл с 500 мкл транспортной среды.
Особенности взятия материала из уретры: – перед взятием биоматериала пациенту рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 1,5-2 часов; – непосредственно перед взятием биоматериала наружное отверстие уретры необходимо обработать тампоном (который можно смочить стерильным физиологическим раствором); – в уретру у мужчин зонд вводится на глубину 1,5-2 см.
Особенности взятия материала из цервикального канала: – перед взятием материала необходимо УДАЛИТЬ ватным тампоном СЛИЗЬ и затем обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором; зонд вводится в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см; – при извлечении зонда необходимо полностью исключить его касание стенок влагалища.
Транспортировка и хранение исследуемого материала. ВНИМАНИЕ! Время от взятия до начала исследования не должно превышать:
- при температуре 18-25 гр. С 48 часов
- при температуре +2…+8 гр. С 2-х недель
- при температуре -18 …- 60 гр. С 2-х месяцев.
Допускается только однократное замораживание/размораживание пробы.
Литература
- Профилактика рака шейки матки: Руководство для врачей. – М.: МЕДпресс-информ, 2008.
- Полонская Н.Ю., Юрасова И.В., Сокольская Т.Ю. Преимущества и эффективность стандартизации цитологических исследований в гинекологии // Клиническая лабораторная диагностика. – 2004. №11 с.47-50.
- Bekkers R., Meijer C., et al. Effects of HPV detection in population-based screening programmers for cervical cancer: a Dutch moment // Gynecol. Oncol. 2006; Mar: 100(3):451-4.
- Khan M., et al. The elevated 10-year risk of cervical precancer and cancer in women with human papillomavirus (HPV) type 16 or 18 and the possible utility of type specific HPV testing in clinical practice // J. nat. cancer inst. 2005; 97:1072-9.
- Snijders J., Meijer C. The value of viral load in HPV detection in screening // HPV today 2006; 8:8-9
Источник
