Впч 16 и рак молочной железы

Human Papillomavirus (HPV) in breast tumors: prevalence in a group of Mexican patients
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2636825/

Рак молочной железы является одной из основных проблем со здоровьем в развитых странах, занимая первое место по смертности среди женщин. Хорошо известно, что существуют факторы риска, связанные с развитием рака молочной железы. Тем не менее, в 50-80% случаев известные факторы риска не были выявлены, это породило попытку идентифицировать новые факторы, связанные с этой неоплазией, как вирусные инфекции. Целью этой работы является исследование распространенности ДНК ВПЧ у пациентов с поражением молочной железы в Национальном институте рака Мексики.

Пятьдесят один случай рака молочной железы был выбран из файлов института и сопоставлен по возрасту и размеру опухоли с 43 случаями незлокачественных повреждений молочной железы (фиброаденома, фиброзно-кистозная болезнь и опухоль филлодов). Отбирали образцы с парафином, ДНК ВПЧ анализировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенировали для различных типов ВПЧ в случае положительности для HPV-ДНК. Был проведен описательный анализ клинических и патологических параметров, проведен сравнительный анализ положительных и отрицательных случаев.

Все пациенты были мексиканскими, средний возраст составил 53,3, средний возраст менархе — 13, а средний размер опухоли — 9 см. Цервиковагинальная цитология была проведена для всех пациентов, у 1 пациента (1,9%) онкологической группы был ВПЧ, а в другой группе нет, ни один случай не был диагностирован с дисплазией шейки матки. В группе карцином 36 (70,5%) были отрицательными и 15 (29,4%) были положительными к ВПЧ-ДНК, 10 (66,6%) были положительными для ВПЧ 16, 3 (20%) для ВПЧ 18, в двух случаях (13,4% ) были положительными для обоих. В группе доброкачественных состояний все были отрицательными к ВПЧ-ДНК.

Наличие ВПЧ при раке молочной железы в нашей группе случаев велико по сравнению с другими авторами; необходимо проанализировать большее число случаев, чтобы установить точную роль этого вируса в патогенезе рака молочной железы.

В развивающихся странах рак молочной железы занимает второе место по частоте, которому предшествует только рак шейки матки, как это отмечалось в отчетах по Мексике [1]. Во всем мире рак молочной железы является одной из основных проблем со здоровьем в развитых странах, занимая первое место в смертности у женщин [2].

Рак молочной железы в Мексике по-прежнему является одной из основных проблем здоровья женского населения. В 2003 году мексиканское общее эпидемиологическое управление сообщило о 12 433 (11,3%) новых случаях инвазивного рака молочной железы и 517 (0,4%) случаев рака на месте с показателем смертности 7,43 / 100 000 жителей [3].

Хорошо известно, что существуют факторы риска, связанные с развитием рака молочной железы (возраст, семейная история, личная история рака молочной железы). Тем не менее, в 50-80% случаев известные факторы риска не были выявлены, что породило попытку выявить новые факторы, связанные с этой неоплазией [1].

Недавние исследования показывают связь вирусных инфекций с патогенезом рака молочной железы, таких как вирус Эпштейна-Барра (EBV) [4] и вирус опухоли молочной железы мыши (MMTV) [5]. Кроме того, выделены последовательности ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ). Хорошо известна связь ВПЧ с другими новообразованиями в других анатомических участках (аногенитальный, верхний аэростигостимулятор и кожа). Поэтому мы знаем, что ВПЧ связано с 99,7% карциномы цервикурита и что существуют определенные типы, которые связаны с пред- и злокачественными поражениями шейки матки [6].

Корреляция ДНК-идентификации ВПЧ и рака молочной железы варьируется в диапазоне от 0 до 86% случаев [7], и, кроме того, это не связано с аногенитальной патологией. На сегодняшний день механизм, с помощью которого вирус достигает груди, не был четко идентифицирован [8].

В настоящее время исследования, оценивающие присутствие ВПЧ в повреждениях молочной железы, практически все проводились в Европе и Азии; мы идентифицировали два, выполненных в США [9,10] и один в Бразилии [8].

Мы провели это ретроспективное исследование с репрезентативным числом злокачественных и не эпителиальных повреждений молочной железы, чтобы исследовать частоту ВПЧ в обоих типах опухолей в группе населения, отличной от изученной другими.

Все пациенты были отобраны из клинических архивов в Национальном институте рака Мексики. Случаи, выбранные с января 1999 года по декабрь 2003 года, в которых имелась полная информация из диаграммы, имели право на дальнейшую оценку.

Из всех случаев, проведенных в нашем учреждении 65, были выбраны, слайды и парафиновые блоки, которые были обнаружены и проанализированы двумя патологоанатомами, был подтвержден диагноз рака молочной железы. Большинство типичных блоков были выбраны для типирования HPV.

Клиническая информация была получена из клинического файла, такого как: Возраст при диагностике, возраст менархе, семейная история рака молочной железы, предыдущая история употребления табака, стадия рака, размер опухоли, гистология, степень опухоли, Scarff-Bloom-Richardson ( SBR), рецепторы эстрогенов и статус рецепторов прогестерона. В качестве контроля использовали сорок три случая злокачественных поражений молочной железы (17 филлод опухолей, 14 фиброаденома и 12 фиброзно-кистозных заболеваний).

Выделение ДНК и впечатывание ВПЧ проводили в Молекулярной лаборатории в Медицинской больнице Медицинского факультета Сикльского университета Карла, Пльзень, Чешская Республика.

Анализ данных проводился с SPSS 15.0 для Windows (SPSS Inc, США). Был проведен описательный анализ клинических и патологических параметров, и сравнение положительных и отрицательных случаев проводилось по критерию хи-квадрат и ученику-t, когда это было необходимо. Статистическая значимость была принята на уровне 5%. Чтобы получить мощность не менее 80%, был рассчитан размер выборки, и для сравнения должно быть оценено не менее 45 случаев. Этот протокол был оценен и одобрен внутренним наблюдательным советом обоих учреждений.

Пять срезов толщиной 5 мкм были вырезаны из ткани FFPE. После каждого образца нож очищали ксилолом и этанолом. Отрицательный контроль состоял из извлеченных кусочков 5-миллиметровой толщины парафиновых блоков, не содержащих ткани и срезанных между образцами ткани. ДНК экстрагировали набором DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) в соответствии с протоколом производителя. Качество изолированной ДНК проверяли с помощью ПЦР контрольных генов с праймерами, генерирующими фрагменты 100, 200, 300, 400 и 600 пар оснований [11].

В соответствии с качеством ДНК использовались различные системы ПЦР для обнаружения и типирования ВПЧ. Если возможно амплифицировать фрагмент контрольных генов более 400 п.н. из ДНК образца (27 образцов), была проведена вложенная ПЦР с использованием MY09 / 11 и GP5 + / 6 +. Вырожденные праймеры MY09 (5’CGTCCMARRGGAWACTGATC 3 ‘) и MY11 (5’GCMCAGGGWCATAAYAATGG 3′) [12] усиливают фрагмент длиной 450 bp в высококонсервативной области в гене L1. Консенсусные праймеры GP5 + (5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3 ‘) и GP6 + (5′-CTTATACTAAATGTCAAATAAAAA-3’) [13] генерируют фрагмент L1 вируса от 140 до 150 пар оснований. Обе системы праймеров обнаруживают широкий спектр онкогенных и неонкогенных слизистых и некоторых слизистых типов ВПЧ.

В случае образцов, где контрольные гены амплифицировались только в диапазоне 100-200 п.н. (14 образцов), применялась одношаговая ПЦР с праймерами GP5 + / 6 +. В образцах еще худшего качества ДНК (10 образцов) использовался набор Genotyping INNO-LiPA HPV (Innogenetics NV, Гент, Бельгия). Набор Genotyping INNO-LiPA HPV позволяет ультрачувствительное детектирование широкого спектра генотипов HPV с помощью ПЦР с праймерами SPF10, который усиливает область длиной 65 п.о. в гене HPV L1 и печатает путем обратной гибридизации (LiPA) [14].

Реакционная смесь (50 мкл) для вложенной ПЦР состояла из 1 × реакционного буфера (Promega), 4 мМ MgCl2, dNTP по 0,2 мМ каждого, праймеров MY09 / 11 0,5 пмоль каждая, 2,5 U Taq полимеразы (Promega) и 5 ​​мкл выделенной ДНК , 3 мкл продукта ПЦР с первой стадии добавляли в реакционную смесь с праймерами GP5 + / 6 +, которые имели идентичный состав, как на первой стадии, за исключением 3,5 мМ MgCl2. ПЦР проводили с использованием следующего профиля: начальная денатурация при 95 ° С в течение 5 мин, 40 циклов 95 ° С в течение 1 мин, либо 50 ° С (отжиг для праймеров MY09 / 11), либо 40 ° С (праймеры GP5 + / 6 +), в течение 1 мин и 72 ° С в течение 1 мин, окончательную инкубацию при 72 ° С в течение 5 мин. В каждой реакции положительный контроль (положительный клинический образец HPV от шейного мазка, в котором подтвержден ВПЧ 16 путем секвенирования) и отрицательный контроль. Отрицательный контроль никогда не был признан положительным. ПЦР проводили на циклической системе PCA GeneAmp 2400 (PE / Applied Biosystems, Foster City, CA). Продукты всех ПЦР разделяли в 2% -ном агарозном геле (агароза для электрофореза ДНК, Серва, Гейдельберг, Германия). Успешно амплифицированные продукты ПЦР очищали с помощью набора для очистки ПЦР QIAquick (QIAGEN), секвенировали с использованием набора для секвенирования большого красителя (PE / Applied Biosystems) и работали на автоматизированном секвенсере ABI Prism 310 (PE / Applied Biosystems) при постоянной напряжение 11,3 кВ в течение 20 минут. Результаты были оценены программой BLAST https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

Генотипирование Inno-LiPA выполнялось в соответствии с протоколом производителя.

Из 65 пациентов, отобранных на группу рака молочной железы, 51 экземпляр показал целостность ДНК путем амплификации контрольных генов, средний возраст составил 53,3 ± 13,2 года (диапазон 27-82), возраст менархе 12,9 ± 1,4 года (диапазон 10-16), 66% (42) пациентов не имели семейной истории рака молочной железы, у пациентов с семейным анамнезом рака молочной железы 12 (18%) имели по крайней мере одного члена семьи с этим заболеванием, только 16,9% пациентов (11) были курильщиками. Цервиковагинальная цитология была проведена для всех пациентов, у 1 пациента (1,9%) онкологической группы был ВПЧ, а в другой группе нет, ни один случай не был диагностирован с дисплазией шейки матки.

Сорок восемь опухолей (94,1%) были карциномами протоков, размер опухоли варьировался от 1 до 17 см (в среднем 9,4 см), 11 опухолей (16,9%) были SBR 8 и 10 опухолей (15,4%) были SBR 9. Эстрогеновые рецепторы были положительными в 15 случаев (23%) и рецепторы прогестерона были положительными у 16 ​​(24,6%).

Пятнадцать случаев были положительными по ВПЧ (29,4%), а 36 случаев (70,5%) были отрицательными, при типизации 10 (66,6%) были положительными для ВПЧ 16, 3 (20%) для ВПЧ 18 и двух случаев (13,3% ) были положительными для ВПЧ 16 и 18. (Рис. 1)

Электрофоретический анализ вложенных продуктов ПЦР. В левой линии — маркер MW, линии с отметкой 34-49 — отрицательные и положительные образцы, размер продукта ПЦР 150 bp, + — положительный контроль (описан в протоколе), 0,0 — двойной отрицательный контроль (ПЦР-премикс без ДНК).

Когда сравнение положительных и отрицательных ВПЧ было выполнено по всем клиническим и патологическим показателям, единственным значимым был размер опухоли, поскольку только одна опухоль размером более 4 см была положительной для ВПЧ (p = 0,008), как показано в таблице 1 ,

Сравнение состояния ВПЧ и клинических переменных.

Все злокачественные повреждения молочной железы были отрицательными для ВПЧ.

Большинство молекулярных событий в генезе рака молочной железы неизвестны. Однако в начальных исследованиях сообщалось об ассоциации рака молочной железы с цервикальной интраэпителиальной неоплазией III (CIN III) -похожим поражениям [9]. Эти исследования вызвали интерес к поиску ВПЧ как части генеза рака молочной железы.

В 1992 году Ди Лонардо и его коллеги первыми продемонстрировали ассоциацию ВПЧ у 29,4% из 17 пациентов с раком молочной железы, идентифицируя ДНК ВПЧ 16 с помощью ПЦР [15]. В 1999 году Yu et al. в исследовательской группе из 72 пациентов, опубликованной по поводу ассоциации между ВПЧ 33 и раком молочной железы у восточного населения (Китай и Япония), что свидетельствует о наличии ДНК ВПЧ 33 в инвазивной протоковой карциноме (IDC) у 34,1% пациентов, изученных и в 5 % доброкачественных поражений, ориентируясь на свое участие в патогенезе рака молочной железы, но не для других серотипов [16].

Hennig et al. сообщила об ассоциации ВПЧ 16 в 19 из 41 карциномы молочной железы (46%) у пациентов с историей поражения CIN III. ДНК HPV 16 была обнаружена при поражении шейки матки у 32 из 38 пациентов с CIN III (84%). Все пациенты с ВПЧ 16 положительными для рака молочной железы соответствовали тем же пациентам с ВПЧ 16 при поражениях CIN III; не было случаев с ВПЧ 11, 18 или 33. ВПЧ 16 был обнаружен в первичных опухолях молочной железы, а также в метастазах в лимфатических узлах, помимо случая отдаленного метастаза рака молочной железы с ВПЧ 16 до двоеточия. Не было никакой корреляции с гистологией опухоли молочной железы, размером опухоли или лимфатической аффектацией, но была обнаружена небольшая связь между экспрессией р53 и -21 у пациентов с раком молочной железы и ВПЧ 16 [17]. Гормональные рецепторы были количественно оценены, но статистически значимой разницы не было найдено [18], этот вывод похож на наш.

Ю в 2000 году снова опубликовал корреляцию ДНК HPV у 14 из 32 (43,8%) пациентов с внутриутробной карциномой, обнаружив ДНК ВПЧ 33 (но не HPV 16 или 18) в положительных случаях. Они предположили, что инфекция, связанная с ВПЧ-33, имеет место в патогенезе рака молочной железы в популяции исследователей [19].

Liu et al. сообщили о значительном количестве повреждений молочной железы, связанных с ВПЧ. Они идентифицировали белок E6 и -7 в шести из 17 (35%) случаев пациентов с раком молочной железы. Клонированные последовательности ВПЧ идентифицировали ДНК в серотипах 16, 18 и, вероятно, 11, в результате чего в молочной железе могут быть произведены те же изменения в p53 и -21 в шейке матки, что указывает на механизм, посредством которого ВПЧ может оказывать влияние на генезис рак молочной железы [9].

Дамин и его коллеги обнаружили HPV у 25 из 101 (24,75%) пациентов с раком молочной железы и не идентифицировали ВПЧ в любом из 41 доброкачественных поражений (20 пациентов с маммопластикой и 21 с фиброаденомами молочной железы). У 14 (56%) пациентов авторы выделили ДНК HPV 16, у 10 (40%) пациентов HPV 18 и у одного пациента (4%) оба серотипа — это исследование с наивысшим номером [8].

Наши результаты аналогичны тем, о которых сообщается в мировой литературе, в которых распространенность от 24 до 46% сообщается в связи с инвазивным раком молочной железы и связанной с ВПЧ инфекцией [8,9,15-20]. В нашей исследовательской группе мы выявили ВПЧ-положительные опухоли в 29,4% случаев, включенных в исследование. Наиболее часто встречалась ДНК HPV 16 (66,6%), о чем сообщалось в других исследованиях [9,15,17-20], в которые были включены западные популяции; ДНК других серотипов не была идентифицирована в этой исследовательской группе. Мы знаем о некоторых возможных расхождениях между аналитической чувствительностью используемых ПЦР-подходов даже со специальными предосторожностями, чтобы избежать минимального загрязнения, которое у нас было; эти возможные расхождения между этими двумя методами могут быть основным ограничением наших результатов. Мы не обнаружили наличия вирусной ДНК в любых доброкачественных поражениях и в любых опухолях филлодов, включенных в нашу серию.

Другие авторы не обнаружили никакой связи между присутствием HPV и раком молочной железы, как в случае с Lindel [21], который не обнаружил вирусной ДНК в группе из 81 случая рака молочной железы.

В нашей серии размер опухоли был единственным статистически значимым значением, показывающим, что чем больше размер поражения, тем больше вероятность нахождения вирусной ДНК в образце опухоли, но не более 4 см, где вирусная ДНК, по-видимому, теряется или не может быть проинформированы или получены. Тем не менее, это было невозможно сопоставить с гистологическим классом или с любым плохим прогнозирующим фактором, который аналогичен результатам Kan et al. [16]; в то время как 48% были положительными для ВПЧ 18, корреляция не могла быть продемонстрирована с другими патологическими переменными или с результатом пациента.

Как сообщалось другими авторами по поводу рака — и даже рака молочной железы — при других локализациях экспрессия белка E6 и -7 была связана с изменениями в p53 и -21, что приводило к ингибированию апоптоза, что благоприятствовало клеточной пролиферации как части патогенеза рака молочной железы [17 ]. Хотя механизм, с помощью которого ВПЧ достигает молочной железы, не ясен, некоторые авторы виремии предположили, что объясняют установку ВПЧ в других органах, в том числе в грудной клетке [20].

Несмотря на это, важно рассмотреть возможность других эпидемиологических факторов, таких как географический сайт, из которых были сделаны случаи и распространенность ВПЧ-инфекции, с тем чтобы определить распределение ВПЧ при злокачественных поражениях груди.

Происхождение рака молочной железы является многофакторным. Тот факт, что мы не нашли вирусную ДНК при доброкачественных поражениях, в определенной степени поддерживает этиологическую роль вируса, по крайней мере, в подгруппе пациентов. Этот механизм не ясен. Таким образом, необходимо включить большее число случаев, чтобы определить истинную роль вируса в генезисе этих поражений, а в мексиканской популяции это новообразование является проблемой проблем со здоровьем в этой области, поэтому исследование, подобное это открывает еще одно возможное объяснение развития болезни.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

DC задумал исследование и принял участие в его разработке и статистическом анализе. ДПМ участвовала в ее разработке, собрании и подборе материала и составлении рукописи. JN проводил изоляцию ДНК и HVP-типизацию, составлял рукопись. IM проводил изоляцию ДНК и печатание ВПЧ, составлял рукопись. EL участвовал в его разработке и составлял рукопись. В. В. выполнил статистический анализ. LC собирают и отбирают материал, дают клиническое наблюдение. AC дал клиническое наблюдение и критический обзор рукописного ОН выбора материала и составил рукопись.

Доступ к этой публикации можно получить здесь:

хттп://ввв.биомедцентраль.ком/1471-2407/я/26/препуб